Attivazione trascrizionale della proteina regolatrice del ciclo cellulare p21WAF1 in cellule che non esprimono p53

Data inizio
1 gennaio 2001
Durata (mesi) 
24
Responsabili (o referenti locali)
Palmieri Marta

La regolazione del ciclo cellulare e’ controllata da chinasi che dipendono da cicline (CDKs) e ne sono i “partners” catalitici. Alterazioni genetiche e mancata regolazione delle CDKs e dei loro regolatori sono strettamente associate allo sviluppo tumorale.
L’adenocarcinoma pancreatico duttale e’ una malattia devastante con scarsa prognosi. Fattori di crescita, oncogeni e soppressori tumorali svolgono un ruolo importante nella sua eziologia. Alterazioni comuni in questi tumori sono: espressione dell’oncogene K-ras, mutazioni nei geni p53, DPC4 e p16, elevata produzione di fattori di crescita e dei loro recettori. Il gene p21WAF1, invece, si presenta generalmente in forma selvatica.
p21WAF1 e’ un inibitore di chinasi ciclina-dipendenti che lega e inibisce tutti i complessi CDK-ciclina di mammiferi ed e’ indotto in modo transiente durante la senescenza replicativa, l’arresto di crescita indotto da danno e il differenziamento terminale. L’espressione ectopica di p21 porta le cellule ad arresto di crescita in fase G1 o G2. Questa funzione e’ mediata da p53 per regolazione trascrizionale del promotore di p21. Al contrario, l’attivazione costitutiva di Ras controlla negativamente la trascrizione del gene di p21, inibendo la fosforilazione e l’attivita’ del fattore di trascrizione Sp1. Sebbene l’espressione di p21 sia regolata principalmente da p53, essa puo’ essere indotta anche da altri fattori di trascrizione. Sostanze che promuovono il differenziamento quali IL6, IFN-g, desametasone, acido retinoico, vitamina D, attivano la trascrizione di p21 con meccanismi indipendenti da p53. Questi induttori determinano il legame di vari fattori di trascrizione, quali Sp1, E2Fs, C/EBPb, C/EBPd, STAT1, STAT3, STAT5, a sequenze di DNA specifiche presenti nel promotore di p21. Inoltre, coattivatori trascrizionali, quali le proteine Smad, p300 e CBP, sono capaci di cooperare con alcuni dei fattori trascrizionali summenzionati per regolare l’espressione del gene di p21. Anche l’acetilazione degli istoni riveste un ruolo importante nella trascrizione del gene di p21: e’ stato dimostrato, per esempio, che l’inibizione dell’attivita’ istone-deacetilasica da parte del SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) induce specificamente l’espressione del gene di p21. L’espressione di p21 puo’ essere regolata anche a livello post-trascrizionale per mezzo del fattore di trascrizione C/EBPa.
Lo scopo di questo progetto di ricerca sara’ quello di identificare e caratterizzare per il loro meccanismo d’azione agenti capaci di attivare l’arresto della crescita cellulare o la risposta apoptotica, in varie linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico, inducendo il gene della p21 in maniera indipendente da p53. Infatti, come descritto nella sezione precedente, nella maggior parte dei tumori pancreatici umani la normale induzione di p21 non avviene a causa di mutazioni nel gene p53 e dell’oncogene K-ras. Quindi, lo studio di vie alternative di induzione di p21 in questi tumori potrebbe essere essenziale per la messa a punto di una nuova terapia anticancro, in cui la bassa efficacia del chemioterapico attualmente usato la gemcitabina, possa essere specificamente aumentata da altri agenti.
Al fine di avere un sistema cellulare di controllo esprimente elevate quantita’ di p21, linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico umano, possedenti il gene p53 mutato e l’oncogene K-ras, saranno stabilmente trasfettate con un vettore contenente il gene della p21 posto sotto il controllo di un promotore inducibile da tetraciclina. Successivamente sara’ analizzata l’eventuale inibizione di crescita cellulare dei cloni trasformati in seguito a trattamento con tetraciclina. Per valutare la vitalita’ cellulare saranno usati i metodi del cristal-violetto, dell’incorporazione di timidina triziata e della formazione di colonie in “soft-agar”. Le cellule saranno quindi analizzate per la presenza di arresto del ciclo con il saggio di citometria di flusso con ioduro di propidio e per apoptosi con i saggi di “DNA laddering”, TUNEL e annessina. La percentuale di inibizione di crescita e apoptosi sara’ correlata con la quantita’ di proteina p21 e del suo messaggio espressi nei differenti cloni dopo induzione con tetraciclina. I cloni esprimenti elevate quantita’ di p21 saranno trattati con i chemioterapici gemcitabina o 5-fluorouracile, insieme con la tetraciclina, ed esaminate per la loro crescita e apoptosi al fine di determinare se l’associazione di due meccanismi di inibizione di crescita possa dare effetti additivi o sinergici.
In parallelo, si studiera’ la capacita’ di vari composti di indurre l’attivazione del gene p21 endogeno in diverse linee di adenocarcinoma pancreatico. A questo scopo saranno utilizzate le citochine IL-6, IFN-g, IFN-a/b e TNF-a e sostanze quali l’acido retinoico, il 4-idrossitamoxifene, il PDTC, la vitamina E, la genisteina, il PMA, il PD98059, la vitamina D, la tricostatina A (TSA) da sole o in combinazione tra loro e sara’ analizzata con saggi di Western blot, Northern blot e/o RT-PCR la loro capacita’ di attivare p21. Saranno poi eseguiti esperimenti di trasfezione transiente, in cellule trattate con i composti summenzionati, con plasmidi contenenti il gene reporter per la luciferasi (LUC) posto sotto il controllo del promotore del gene della p21. La sequenza bersaglio di DNA per ogni composto sara’ identificata in saggi di trasfezione eseguiti con mutanti di delezione del promotore del gene di p21. Per identificare i fattori che legano le regioni di DNA bersaglio saranno eseguiti EMSAs (electroforetic mobility shift assays) con estratti nucleari ottenuti da cellule indotte e sonde oligonucleotidiche corrispondenti alla regione di DNA identificata per trasfezione. Sara’ saggiata anche l’attivita’ di fattori di trascrizione che, sulla base di omologia di sequenza, dovrebbero legare il promotore di p21. Plasmidi esprimenti C/EBPb, C/EBPd, IRF-1, IRF-2, STAT1, STAT3 e le subunita’ p50 e p65 di NF-kB saranno cotrasfettati con il vettore contenente il promotore di p21 e il gene della luciferasi e sara’ misurata l’attivita’ luciferasica. I risultati di tutti questi esperimenti ci permetteranno di identificare, nelle cellule esaminate, le vie di trasduzione del segnale attive nell’induzione di p21 e gli associati fattori di trascrizione. I migliori induttori di p21 saranno scelti per determinare la loro capacita’ di arrestare la crescita cellulare o di portare ad apoptosi linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico in assenza o in presenza di gemcitabina o di 5-fluorouracile.
Giacche’ gli inibitori di deacetilasi istoniche, quali la TSA, hanno mostrato la proprieta’ di rendere reversibile il fenotipo di linee cellulari trasformate indipendentemente dallo stato del gene di p53, particolare interesse sara’ dedicato all’attivita’ della TSA o di altri inibitori di deacetilasi istoniche sull’attivazione di p21. La comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della loro attivita’ ci permettera’ di stabilire un protocollo che utilizzi diversi induttori e dia l’attivazione ottimale del gene di p21.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito dal dipartimento

Partecipanti al progetto

Chiara Costanzo
Mario Dandrea
Massimo Donadelli
Professore associato
Marta Palmieri
Professore ordinario

Attività

Strutture