Analisi dei polimorfismi nei geni del sistema di detossificazione quali fattori di rischio per tumori cutanei in pazienti immunodepressi per trapianto d'organo

Data inizio
25 settembre 2005
Durata (mesi) 
24
Dipartimenti
Medicina, Neuroscienze, Biomedicina e Movimento
Responsabili (o referenti locali)
Turco Alberto

Premessa
I pazienti trapiantati d’organo presentano numerosi fattori di rischio per tumori cutanei non melanoma (NMSC) (Ramsay et al. 2000, Birkeland et al. 1000, Bouwes bavinck et al. 1994). I principali fattori di rischio sono: l’esposizione ai raggi UV, l’immunodepressione iatrogena, le caratteristiche somatiche del paziente (cute ed occhi chiari, capelli biondi) e un’età al trapianto maggiore di 40 anni (Ramsay et al. 2003, Marshal et al. 2000). L’incidenza cumulativa degli epiteliomi nei trapiantati è del 10% dopo 5 anni e del 40% dopo 10 e 20 anni dal trapianto. Recenti studi hanno identificato come fattori di rischio alcuni polimorfismi genici degli enzimi del metabolismo cellulare (Fryer et al. 2005, Ramsay et al. 2001, Belloni et al. 2000, Marchall et al. 1000, Smith et al. 1996, Yengi et al. 1996, Lear et al. 1996). In particolare, l’espressione e regolazione coordinata degli enzimi metabolizzanti (fase I e fase II) ed il loro equilibrio nelle cellule degli organi bersaglio possono determinare la predisposizione allo sviluppo di tumori. Oltre a mostrare variabilità nella loro attività, dovuta ad induzione o inibizione, questi enzimi hanno polimorfismi genetici che possono alterare la loro attività enzimatica. Diversi studi hanno mostrato che polimorfismi delle GST e del citocromo p-450 e alcune loro combinazioni risultano associati alla predisposizione a diversi tipi di tumori (Cantay et al. 1991, Marchall et al. 2000, Smith et al. 1996, Kihara et al. 1995, Yengi et al. 1996, Lear et al. 1996, Hengstler et al. 1998).

Durante il periodo 2003-2005 sono stati arruolati, dalle Cliniche Universitarie di Dermatologia di Verona, Padova (Direttore Prof. A. Peserico- Referente Dott. S. Piaserico) e di Milano Bicocca (Bergamo) (Referente Dott. Luigi Naldi), 237 pazienti trapiantati d’organo. I pazienti trapiantati renali e cardiaci affetti da tumori cutanei non melanoma sono stati abbinati a controlli trapiantati di ugual sesso, età, durata del trapianto esenti da tumore dopo almeno 5 anni dal trapianto. Finora sono state analizzate le frequenze dei polimorfismi dei geni GSTM1 (alleli A,B e null), polimorfismi del gene GSTT1(alleli A e null), polimorfismi del geneGSTP1(alleli A,B,C, e D) e polimorfismi del gene CYP1A1 (alleli Msp I e IIe/Val 462). I risultati ottenuti dimostrano una associazione fra il genotipo GSTM1 null/null ad un aumentato rischio di tumore, specialmente BCC (Basal Cancer Cell) [null/null vs A+B, p=0.003; OR: 3.09 (1.42-6.80)]. Anche polimorfismi del gene GSTP1 mostra una associazione con NMSC, essendo la presenza del genotipo Val/Val104 più frequente nei controlli che nei casi [p=0.023; OR: 0,1 (0.00-0.7)]. L’analisi univariante dei polimorfismi del CYP1A1 non arriva ad una significatività statistica però la frequenza dell’allele CYP1A1 Val462 è maggiore nei casi che nei controlli. L’analisi a coppie degli alleli ha dimostrato che l’allele a rischio GSTM1 null/null, se si presenta insieme all’allele CYP1A1 Val462, aumenta il rischio di tumore SCC(Squamous Cancer Cell) di sei volte ([p=0.01;OR:6.5 (1.4-34.4)].
L’analisi dei dati clinici ha riscontrato un aumento del rischio per tumore cutaneo statisticamente significativo con l’età al trapianto >= 45 anni (OR 4.07 p<0,044) la presenza di un grave foto-danneggiamento della cute (OR 10,73 p<0.031) e di lesioni cutanee pre-cancerose quali le cheratosi attiniche(OR 4.98 p<0.010). Non abbiamo riscontrato correlazione significativa tra tumori cutanei, colore degli occhi, colore dei capelli e della cute, tendenza alle ustioni e numero di ustioni gravi avvenute nel corso dell’esistenza. Inoltre, il tipo di farmaco immunosopressore (Ciclosporina, azatioprina, MMF, tacrolimus, cortisonici), o la combinazione di più farmaci immunosoppressori non correlava in modo statisticamente significativo con il rischio di tumori cutanei.
Lo studio si propone di continuare la raccolta di campioni e d’ampliare lo studio ad altri polimorfismi in geni coinvolti nel sistema di detossificazione quali il citocromo p450 CYP2D6 e CYP2E1 della fare I, e i geni che codificano per la GSTM3, le N-acetil-transferasi e le sulfotansferasi della fase II del sistema di detossificazioni.

RISULTATI ATTESI
1. L’obiettivo di questo studio è di creare nel tempo una banca per la raccolta di DNA di pazienti trapiantati affetti e non affetti da tumori cutanei, provenienti da più centri distribuiti sul territorio nazionale (utili per questo studio e per altri eventuali studi futuri).
2. D’indagare se polimorfismi nei geni codificanti alcuni componenti del sistema di detossificazione possano essere associati, indipendentemente o insieme a fattori clinici e ambientali, ad una maggiore predisposizione a NMSC. Lo scopo finale è quello di poter identificare precocemente sotto gruppi di pazienti trapiantati ad elevato rischio di NMSC, permettendo di adottare misure precoci di screening e prevenzione, con evidenti benefici medici, sanitari, economici e sociali. Nel caso tale ipotesi sia verificata sarebbe auspicabile la messa a punto di un test di screening per identificare, sin dall’immissione in lista di trapianto, i pazienti a più elevato rischio di tumori cutanei, da sottoporre ad un monitoraggio dermatologico più accurato

MATERIALI E METODI
Lo studio viene inteso come studio caso-controllo: ogni paziente che abbia subito un trapianto da almeno 5 anni ed affetto da neoplasia sarà abbinato ad 1 controllo sano di analoga età e trapiantato nello stesso anno. Di tutti pazienti (casi e controlli) saranno registrati: anamnesi familiare e personale per neoplasie cutanee, precedenti ustioni in età infantile, tipo di lavoro e passatempi, abitudini di esposizione solare durante il lavoro, il tempo libero e le vacanze.
L’esame clinico rileva tipo e colorito cutaneo, colore degli occhi e dei capelli, presenza di lesioni pre-cancerose o di segni di un’intensa esposizione solare (lentiggini solari, efelidi). A tutti i pazienti, previo consenso informato, saranno prelevati 5 ml di sangue per lo studio genetico. L’estrazione del DNA verrà effettuata da sangue periferico utilizzando la tecnica standard di “salting out”.
GENOTIPIZZAZIONE
GSTM£
Sono presenti gli alleli A e B. L’allele B presenta una delezione di tre paia di basi nell’introne 6. Questo allele può essere identificato mediante amplificazione con un primer fluorescinato ad analisi al sequenziatore automatico 377 ABI PRISM utilizzando il programma Gene Scan.
Gene CYP2D6
I tre alleli polimorfici più comuni (del!2637, G>A fra l’introne 3 e l’esone 4 e una delezione completa del gene) saranno genotipizzati mediante PCR e successive restrizioni enzimatiche seguendo protocolli già definiti da Smith et al. 1992.
Gene CYP2E1
Sette differenti loci polimorfici sono stati identificati ma solamente uno(CYP2E1*2) appare coinvolto in un alterato metabolismo di substrati. Il polimorfismo consiste in una singola sostituzione nucleotidica nella regione 5’ ed è identificabile mediante PCR e digestione con l’enzima RsaI (Hayashi SI et al. 1991). Per l’identificazione dei rimanenti polimorfismi verrà sviluppata una metodica basata s PCR multiplex in modo da ridurre il numero di reazioni necessarie.
N-ACETIL-TRANSFERASI
Polimorfismi del gene NAT2: la genotipizzazione dei polimorfismi nel gene NAT2 verrà eseguita secondo i protocolli Smith et al. 1997. In breve: dopo amplificazione con primers predefiniti, i polimorfismi alle posizioni nucleotidiche 481,803,590 e 847 saranno identificati mediante elettroforesi dei frammenti di PCR digeriti opportunamente con i seguenti enzimi di restrizione: KnpnI, DdelI, TaqI e bamHI.
SULFONTRANSFERASI
L’arilsulfontransferasi SULT1A1 sembra possedere una ridotta attività enzimatica e una ridotta termostabilità se l’Arg (wild-type) in posizione 213 è sostituita da His (allele SULT1A1*1). La relativa genotipizzazione, mediante PCR-analisi RFLP, sarà eseguita secondo il protocollo descritto da Coughtrie et al.1999.

Partecipanti al progetto

Maria Macarena Gomez
Ricercatore
Lisa Provezza

Collaboratori esterni

Silvia Mazzola
Università di Verona Dipartimento di Scienze Biomediche e Chirurgiche

Attività

Strutture